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革兰氏阳性菌质粒大量提取试剂盒(50~200mL)图片
产品货号:
QN0901
中文名称:
革兰氏阳性菌质粒大量提取试剂盒(50~200mL)
英文名称:
Gram-positive Bacterium Plasmid DNA Extraction Maxi Kit(50-200mL)
产品规格:
10T
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本试剂盒用于Gram+细菌中提取质粒,一次可处理50~200mL菌液。

试剂盒组成:
组分规格
RNase A1mL
溶菌酶10mL
溶液Ⅰ60mL
溶液Ⅱ60mL
溶液Ⅲ80mL
漂洗液15mL×2
洗脱液30mL
吸附柱10个
收集管20个

注意:使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶体上的标签。溶液Ⅰ在使用前先加入RNase A(将试剂盒中提供的RNase A全部加入),混匀,置于2~8℃保存。如非指明,所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

保存:RNase A和溶菌酶于-20℃保存,其它试剂室温保存,复检期一年。

注意事项:
  • 使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出现混浊,如有混浊现象,可在37℃水浴中加热几分钟,待溶液恢复澄清后再使用。
  • 洗脱缓冲液体积不应少于500μL,体积过小影响回收效率;洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响,若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围),pH值低于7.0会降低洗脱效率。
    DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解。
  • 如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒,应加大菌体使用量,使用400~800mL过夜培养物,同时按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量,吸附和洗脱时可以适当的延长时间,以增加提取效率。
  • DNA浓度及纯度检测:得到的质粒DNA纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。得到的DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有显著吸收峰,OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA、40μg/ml单链DNA。OD260/OD280比值应为1.7~1.9,如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,而使用去离子水,比值会偏低,因为pH值和离子存在会影响光吸收值,但并不表示纯度低。


操作步骤:
  • 取50~200mL细菌培养物,11000rpm离心5min,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
  • 向留有菌体沉淀的离心管中加入5mL溶液Ⅰ和1mL溶菌酶,混匀。37℃水浴30min以上(根据菌液量可适当加长水浴时间,请先检查溶液Ⅰ是否已加入RNase A),使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
    注意:如果菌块未彻底混匀,会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。
  • 向离心管中加入5mL溶液Ⅱ,温和地上下翻转6~8次使菌体充分裂解。
    注意:混匀一定要温和以免污染基因组DNA,此时菌液应变得清亮粘稠,作用时间不要超过5min,以免质粒受到破坏。
  • 向离心管中加入7mL溶液Ⅲ,立即温和地上下翻转6~8次,充分混匀,此时会出现白色絮状沉淀。11000rpm离心10min,用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中,尽量不要吸出沉淀。注意:溶液Ⅲ加入后应立即混匀,避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。
  • 将上一步所得上清液加入吸附柱中(吸附柱加入收集管中),室温放置2min,11000rpm离心2min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中(如果一次加不完,可分两次吸附)。
  • 向吸附柱中加入7mL漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),11000rpm离心2min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。
  • 向吸附柱中加入7mL漂洗液,11000rpm离心2min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。
  • 11000rpm离心5min,将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,否则漂洗液中的乙醇会影响后续实验如酶切、PCR等。
  • 将吸附柱放入一个干净的离心管中,向吸附膜中央悬空滴加1~2mL经65℃水浴预热的洗脱液,室温放置5min,11000rpm离心2min,收集质粒DNA溶液。
  • (可选)为了增加质粒的回收率,可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中,室温放置5min,11000rpm离心2min。

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