革兰氏阳性菌质粒大量提取试剂盒(50～200mL)

产品货号：

QN0901

中文名称：

革兰氏阳性菌质粒大量提取试剂盒(50～200mL)

英文名称：

Gram-positive Bacterium Plasmid DNA Extraction Maxi Kit(50-200mL)

产品规格：

10T

发货周期：

1～3天

产品价格：

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本制品是百奥莱博公司基于离心吸附柱法开发的，专门用于革兰氏阳性(Gram+)细菌中质粒大量提取的试剂盒，一次可处理的菌液量达50～200mL。

组分	规格
溶液Ⅰ	60mL
溶液Ⅱ	60mL
溶液Ⅲ	80mL
漂洗液	15mL×2
洗脱液	30mL
吸附柱	10个
收集管	20个
RNase A	300μL×2
溶菌酶	200mg

保存：室温，其中溶菌酶和RNaseA需置于-20℃保存，有效期1年。

准备工作

首次使用前请先向每瓶漂洗液15mL的中加入45mL无水乙醇，并做好标记防止重复加入。
首次使用前请先将试剂盒提供的RNase A全部加入到溶液Ⅰ中，混匀，置于2～8℃保存。
溶菌酶使用前需要用50%甘油配制成20mg/mL，建议现用现配，或者分多次配制。
如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出现混浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，待溶液恢复澄清后再使用。
洗脱缓冲液体积不应少于500μL，体积过小影响回收效率；洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响，若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率。DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，使用400～800mL过夜培养物，同时按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率。

取50～200mL细菌培养物，11000rpm离心5min，尽量吸除上清。
- 菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。
向留有菌体沉淀的离心管中加入5mL溶液Ⅰ和1mL溶菌酶，混匀。37℃水浴30min以上，使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
- 请先检查溶液Ⅰ是否已加入RNase A。
- 水浴时间可根据菌液量可适当延长。
- 如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。
向离心管中加入5mL溶液Ⅱ，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解。
- 混匀一定要温和以免污染基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过5min，以免质粒受到破坏。
向离心管中加入7mL溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。11000rpm离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。
- 溶液Ⅲ加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
取上一步上清，加入0.5倍体积无水乙醇，充分混匀。
- 体积过多可分两次混合，然后上柱。
将上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室温放置2min，11000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
- 如果一次加不完，可分两次吸附。
向吸附柱中加入7mL漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），11000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
向吸附柱中加入7mL漂洗液，11000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
11000rpm离心5min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续实验如酶切、PCR等。
将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加1～2mL经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，11000rpm离心2min，收集质粒DNA溶液。
可选步骤：为了增加质粒的回收率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置5min，11000rpm离心2min。

DNA浓度及纯度检测：

得到的质粒DNA纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。得到的DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50μg/mL双链DNA、40μg/mL单链DNA。OD260/OD280比值应为1.7～1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。

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